Leu, Wei-Ming
呂維茗 副教授
Email: [email protected]
地址:中興大學食品暨生物科技大樓7F
Office phone: (04) 2284-0328 ext.767
Lab phone: (04) 2284-0328 ext.769
主要教授課程
- 上學期:
高等生化(研究所)
分子發育生物學(研究所)
分子生物學技術(大學部及研究所)
文獻選讀-植物分子生物(研究所)
- 下學期:
植物基因體學(研究所)
分子生物學技術(大學部及研究所)
- 暑期:
學經歷
- B.S., National Taiwan University, Dept. of Horticulture, 1980~1984
- M.S., National Yang-Ming Medical College, Inst. of Biochemistry, 1986~1987
- Ph.D., National Yang-Ming Medical College, Inst. of Biochemistry, 1987~1991
- Post-doctoral Fellow, The Rockefeller University, Lab. of Plant Mol. Biol., 1991~1995
- Associate Professor, National Chung-Hsing University, 1995~ present
研究專長
分子生物與生物化學
研究主題
1. 水稻CDPK激活酵素調控花粉發育機制之研究
2. 水稻突變體之遺傳分析與突變基因之據圖選殖
3. 提高植物輔助蛋白之表現增進農桿菌基因轉殖效率
2. 水稻突變體之遺傳分析與突變基因之據圖選殖
3. 提高植物輔助蛋白之表現增進農桿菌基因轉殖效率
研究主題簡介
人類的三大主要糧食- 小麥、玉米與水稻均屬於禾本科單子葉植物,其中水稻由於其基因組小而單純,故被選定進行完整的基因組解序計畫,國際水稻定序組織(IRGSP)並於2005年公佈梗稻亞種(Oryza sativa L. ssp. japonica)完整的基因組序列,成為國際共享的資源,透過網路查詢即可得知水稻中每個基因在染色體上的位置、序列、與特性。除了基因資訊容易獲得之外,水稻的基因轉殖流程亦已建立,更有各地域長年所累積的種原資源,使得水稻成為單子葉的模式植物,透過基因選殖與植物轉殖策略,可以快速研究許多功能不明之基因的角色,廣稱為”功能性基因體分析”。環繞此一主題,茲將本實驗室的研究工作分為三個項目簡介如下-
1. 水稻結鈣激活酵素調控花粉發育機制之研究
本研究策略乃以²基因²為出發點,探索基因之功能及其參與之生物角色,屬於²reverse genetic approach²。
鈣離子是花粉發育、花粉萌發、與花粉管延長的必要元素,其訊息經常藉由結鈣蛋白傳導,本實驗室針對成熟花粉專一表現之結鈣激活酵素(Oryza sativa Calcium-dependent calmodulin-independent Protein kinase,簡稱OSCK1),研究其於花粉發育至萌發過程所扮演的角色。經由定點突變,本實驗室創造出不同版本的OSCK1,例如使之失去酵素活性、使之不受鈣離子調控活性、或是改變其胞內分布位置等;並建立各種分析系統,例如基因槍暫時性轉殖百合花粉、穠桿菌暫時性轉殖菸草葉片、水稻轉殖植物、與阿拉伯芥轉殖植物等,以偵測植物細胞大量表現上述蛋白所衍生的反應,據以闡釋OSCK1在原始花粉中可能扮演之生理角色。
另一方面,由於OSCK1具有激活酵素活性,合理推測花粉中應有其下游受質蛋白,因此透過酵母菌雙雜交系統選殖,本實驗室自水稻花粉中釣出數個與OSCK1具有高度親和性的蛋白,名之為OSCK1-Interacting Protein,簡稱OIP,其中OIP30被預測具有helicase的活性,可能扮演直接調控基因表現的重要功能。由far-western, in vitro pull-down,co-immunoprecipitation等實驗結果,亦均證實OIP30與OSCK1具有高度親和力,OIP30並可受OSCK1磷酸化酵素活性作用,故推測OIP30應為OSCK1在花粉中之下游受質蛋白。預期未來此主題之研究方向有二:
(1) 闡明OSCK1與OIP30蛋白於水稻花粉之生理意義- 包括分析OSCK1與OIP30之胞內分佈位置,檢查其是否可受鈣離子訊息調節而共同(或各自)移動位置,從附著於胞膜移轉入核,以執行OIP30之功能?失去激活酵素活性的OSCK1是否即無法移動?
(2) 闡明水稻花粉中其它CDPK蛋白之生理意義- 除了OSCK1之外,水稻中另有六個同樣僅於成熟花粉大量表現的CDPK基因,根據其基因結構、蛋白序列相似性、以及演化樹分析結果,可將七個基因區分為兩群,預期同群組之基因或許功能相似,但不同群者之生物角色與活性應有差異,本實驗室希望利用前述已建立之分析系統,以及多基因同時靜默之植物轉殖分析,釐清此兩群CDPK基因於花粉發育、花粉萌發、或花粉管延長之功能差異?
參與本實驗所需之基礎知識(與技能):
分子生物學 (質體構築,DNA、RNA抽取與分析,基因槍轉殖)
生物化學 (蛋白純化,酵素活性分析,蛋白交互作用分析)
細胞生物學 (花粉、花藥觀察分析- 解剖顯微鏡、螢光顯微鏡、共軛聚焦顯微鏡分析)
2. 水稻突變體之遺傳分析與突變基因之據圖選殖
本研究策略乃以²性狀²為出發點,探索性狀背後的主控基因與調控機制,屬於²forward genetic approach²。由於水稻具有豐富的突變體材料,其基因組又已被完整解序,故經由高解析度的分子標誌(molecular marker)分析後,多可直接選出性狀背後的主控基因,稱為²基因之據圖選殖 (map-based gene cloning) & sup2;,為現今”功能性基因體分析”的重要利器之ㄧ。
台農67與SA1613.1均屬外觀正常且豐產的水稻品系,然而其F2子代族群之穗數性狀卻有明顯的分離現象,除了個體差異呈現連續性分布外,更有許多超親遺傳的植株。為了尋找調控此穗數的主效數量遺傳基因座(major QTL),進行其分子定位,首先搜尋於上述親本材料中具有差異性且均勻分布於全基因組的DNA分子標誌,以親本之F2子代族群為mapping population,一一鑑定其中所有植株各個分子標誌的基因型,之後與其穗數性狀進行變異數分析 (Analysis of Variance, 簡稱ANOVA),找出與穗數性狀相連鎖的分子標誌,預期在分子標誌附近的染色體區塊上,即帶有調控性狀的基因。而由於水稻基因組已完整解序,故透過資料庫搜查,可立即得知分子標誌的染色體位置。目前本實驗室認為至少有兩個主效基因座共同控制穗數性狀,分別為位於第一與第十一條染色體的qPN1與qPN11,均對於性狀變異具有~22%的影響。預期未來此主題之研究方向有二:
(1) qPN1與qPN11基因座之精密定位與分子選殖-以多次回交法(recurrent backcrossing)產生基因組大部份相同,惟qPN1或qPN11位置附近具有差異的兩個近同源品系 (Near-Isogenic Line,簡稱NIL),以便分析單純qPN1或單純qPN11對於穗數性狀的影響程度,並精密定位qPN1或qPN11於200 Kb的染色體區間內,以進行基因之分子選殖。
(2) 詳細分析近同源品系的性狀差異- 進行細胞學觀察與荷爾蒙添加等實驗,深入暸解qPN1或qPN11基因座變異對於穗數性狀的影響,並檢查是否有其他的性狀差異。
參與本實驗所需之基礎知識(與技能):
分子生物學 (質體構築,基因組DNA抽取,分子標誌分析)
遺傳學與生物統計學 (遺傳分析程式之使用與判讀)
基因體學 (基因體資料庫之搜查與判讀)
植物學 (組織解剖,染色分析)
3. 提高植物輔助蛋白之表現增進農桿菌基因轉殖效率
農桿菌之植物基因轉殖技術雖已建立超過二十年,但現今仍有許多高經濟價值的植物轉殖效率低落且不穩定,甚至完全無法轉殖,而能被轉殖者,亦常常侷限於特定品種,嚴重妨礙將有用的基因導入目標作物的工作。本研究乃利用農桿菌T-DNA的暫時性大量表現作用,在植物細胞中短暫大量表達特定的植物蛋白質,以幫助其他T-DNA分子運送入細胞核,插入染色體,成為永久性轉殖基因的過程;或是提高被轉殖之植物細胞後續的再生能力,使之克服初步細胞分裂的障礙,兩者作用皆可能大幅提高植物的基因轉殖效率,解決現今基因轉殖植物性狀改良工作效率不彰的瓶頸。
參與本實驗所需之基礎知識(與技能):
分子生物學 (質體構築,RT-PCR基因選殖,啟動子活性分析,報告基因活性分析)
植物學 (植物組織培養、轉殖、與再生)
1. 水稻結鈣激活酵素調控花粉發育機制之研究
本研究策略乃以²基因²為出發點,探索基因之功能及其參與之生物角色,屬於²reverse genetic approach²。
鈣離子是花粉發育、花粉萌發、與花粉管延長的必要元素,其訊息經常藉由結鈣蛋白傳導,本實驗室針對成熟花粉專一表現之結鈣激活酵素(Oryza sativa Calcium-dependent calmodulin-independent Protein kinase,簡稱OSCK1),研究其於花粉發育至萌發過程所扮演的角色。經由定點突變,本實驗室創造出不同版本的OSCK1,例如使之失去酵素活性、使之不受鈣離子調控活性、或是改變其胞內分布位置等;並建立各種分析系統,例如基因槍暫時性轉殖百合花粉、穠桿菌暫時性轉殖菸草葉片、水稻轉殖植物、與阿拉伯芥轉殖植物等,以偵測植物細胞大量表現上述蛋白所衍生的反應,據以闡釋OSCK1在原始花粉中可能扮演之生理角色。
另一方面,由於OSCK1具有激活酵素活性,合理推測花粉中應有其下游受質蛋白,因此透過酵母菌雙雜交系統選殖,本實驗室自水稻花粉中釣出數個與OSCK1具有高度親和性的蛋白,名之為OSCK1-Interacting Protein,簡稱OIP,其中OIP30被預測具有helicase的活性,可能扮演直接調控基因表現的重要功能。由far-western, in vitro pull-down,co-immunoprecipitation等實驗結果,亦均證實OIP30與OSCK1具有高度親和力,OIP30並可受OSCK1磷酸化酵素活性作用,故推測OIP30應為OSCK1在花粉中之下游受質蛋白。預期未來此主題之研究方向有二:
(1) 闡明OSCK1與OIP30蛋白於水稻花粉之生理意義- 包括分析OSCK1與OIP30之胞內分佈位置,檢查其是否可受鈣離子訊息調節而共同(或各自)移動位置,從附著於胞膜移轉入核,以執行OIP30之功能?失去激活酵素活性的OSCK1是否即無法移動?
(2) 闡明水稻花粉中其它CDPK蛋白之生理意義- 除了OSCK1之外,水稻中另有六個同樣僅於成熟花粉大量表現的CDPK基因,根據其基因結構、蛋白序列相似性、以及演化樹分析結果,可將七個基因區分為兩群,預期同群組之基因或許功能相似,但不同群者之生物角色與活性應有差異,本實驗室希望利用前述已建立之分析系統,以及多基因同時靜默之植物轉殖分析,釐清此兩群CDPK基因於花粉發育、花粉萌發、或花粉管延長之功能差異?
參與本實驗所需之基礎知識(與技能):
分子生物學 (質體構築,DNA、RNA抽取與分析,基因槍轉殖)
生物化學 (蛋白純化,酵素活性分析,蛋白交互作用分析)
細胞生物學 (花粉、花藥觀察分析- 解剖顯微鏡、螢光顯微鏡、共軛聚焦顯微鏡分析)
2. 水稻突變體之遺傳分析與突變基因之據圖選殖
本研究策略乃以²性狀²為出發點,探索性狀背後的主控基因與調控機制,屬於²forward genetic approach²。由於水稻具有豐富的突變體材料,其基因組又已被完整解序,故經由高解析度的分子標誌(molecular marker)分析後,多可直接選出性狀背後的主控基因,稱為²基因之據圖選殖 (map-based gene cloning) & sup2;,為現今”功能性基因體分析”的重要利器之ㄧ。
台農67與SA1613.1均屬外觀正常且豐產的水稻品系,然而其F2子代族群之穗數性狀卻有明顯的分離現象,除了個體差異呈現連續性分布外,更有許多超親遺傳的植株。為了尋找調控此穗數的主效數量遺傳基因座(major QTL),進行其分子定位,首先搜尋於上述親本材料中具有差異性且均勻分布於全基因組的DNA分子標誌,以親本之F2子代族群為mapping population,一一鑑定其中所有植株各個分子標誌的基因型,之後與其穗數性狀進行變異數分析 (Analysis of Variance, 簡稱ANOVA),找出與穗數性狀相連鎖的分子標誌,預期在分子標誌附近的染色體區塊上,即帶有調控性狀的基因。而由於水稻基因組已完整解序,故透過資料庫搜查,可立即得知分子標誌的染色體位置。目前本實驗室認為至少有兩個主效基因座共同控制穗數性狀,分別為位於第一與第十一條染色體的qPN1與qPN11,均對於性狀變異具有~22%的影響。預期未來此主題之研究方向有二:
(1) qPN1與qPN11基因座之精密定位與分子選殖-以多次回交法(recurrent backcrossing)產生基因組大部份相同,惟qPN1或qPN11位置附近具有差異的兩個近同源品系 (Near-Isogenic Line,簡稱NIL),以便分析單純qPN1或單純qPN11對於穗數性狀的影響程度,並精密定位qPN1或qPN11於200 Kb的染色體區間內,以進行基因之分子選殖。
(2) 詳細分析近同源品系的性狀差異- 進行細胞學觀察與荷爾蒙添加等實驗,深入暸解qPN1或qPN11基因座變異對於穗數性狀的影響,並檢查是否有其他的性狀差異。
參與本實驗所需之基礎知識(與技能):
分子生物學 (質體構築,基因組DNA抽取,分子標誌分析)
遺傳學與生物統計學 (遺傳分析程式之使用與判讀)
基因體學 (基因體資料庫之搜查與判讀)
植物學 (組織解剖,染色分析)
3. 提高植物輔助蛋白之表現增進農桿菌基因轉殖效率
農桿菌之植物基因轉殖技術雖已建立超過二十年,但現今仍有許多高經濟價值的植物轉殖效率低落且不穩定,甚至完全無法轉殖,而能被轉殖者,亦常常侷限於特定品種,嚴重妨礙將有用的基因導入目標作物的工作。本研究乃利用農桿菌T-DNA的暫時性大量表現作用,在植物細胞中短暫大量表達特定的植物蛋白質,以幫助其他T-DNA分子運送入細胞核,插入染色體,成為永久性轉殖基因的過程;或是提高被轉殖之植物細胞後續的再生能力,使之克服初步細胞分裂的障礙,兩者作用皆可能大幅提高植物的基因轉殖效率,解決現今基因轉殖植物性狀改良工作效率不彰的瓶頸。
參與本實驗所需之基礎知識(與技能):
分子生物學 (質體構築,RT-PCR基因選殖,啟動子活性分析,報告基因活性分析)
植物學 (植物組織培養、轉殖、與再生)
期刊論文
- Wang CW, Chen WC, Lin LJ, Lee CT, Tseng TH and Leu WM* (2011) OIP30, a RuvB-like DNA Helicase 2, is a Potential Substrate for the Pollen-Predominant OsCPK25/26 in Rice. Plant & Cell Physiology 52(9): 1641–1656. (SCI)
- Chang YY, Chu YW, Chen CW, Leu WM, Hsu HF and Yang CH (2011) Characterization of Oncidium ‘Gower Ramsey’ Transcriptomes using 454 GS-FLX Pyrosequencing and Their Application to the Identification of Genes Associated with Flowering Time Plant & Cell Physiology 52(9): 1532–1545. (SCI)
- Shiue SJ, Chien IL, Chan NL, Leu WM and Hu NT (2007) Mutation of a key residue in the type II secretion system ATPase uncouples ATP hydrolysis from protein translocation. Molecular Microbiology 65(2): 401–412. (SCI)
- Shiue SJ, Chien IL, Chan NL, Leu WM and Hu NT (2007) Mutation of a key residue in the type II secretion system ATPase uncouples ATP hydrolysis from protein translocation. Molecular Microbiology 65(2), 401–412. (SCI)
- Shiue SJ, Kao KM, Leu WM, Chen LY, Chan NL and Hu NT (2006) XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL. The EMBO J. 25 (7): 1426-1435. (SCI)
- Lee MS, Chen LY, Leu WM, Shiau RJ and Hu NT (2005) Associations of the major pseudopilin XpsG with XpsN (GspC) and secretin XpsD of Xanthomonas campestris pv. campestris type II secretion apparatus revealed by crosslinking analysis. J. Biol. Chem. 280(6):4585-91. (SCI)
- Lee HM, Chen JR, Lee HL, Leu WM, Chen LY and Hu NT. (2004) Functional dissection of the XpsN (GspC) protein of the Xanthomonas campestris pv. campestris type II secretion machinery. J. Bacteriol. 186(10):2946-55. (SCI)
- Tsai RT, Leu WM, Chen LY and Hu NT (2002) A reversibly dissociable ternary complex formed by XpsL, XpsM and XpsN of the Xanthomonas campestris pv. campestris type II secretion apparatus. Biochem J. 367:865-871. (SCI)
- Yang JY, Chung MC, Tu CY and Leu WM (2002) OSTF1: A HD-GL2 Family Homeobox Gene Is Developmentally Regulated During Early Embryogenesis in Rice. Plant Cell Physiology, 43(6):628-638. (SCI)
- Hu NT, Leu WM, Lee MS, Chen A, Cheng SC, Song YL and Chen LY (2002) XpsG, the major pseudopilin in Xanthomonas campestris pv. campestris, forms pilus-like structure between cytoplasmic and outermembrane. Biochem. J. 365:205-211. (SCI)
- Lee HM, Tyan SW, Leu WM, Chen LY, Chen DC and Hu NT (2001) Involvement of the XpsN protein in formation of the XpsL-XpsM complex in Xanthomonas campestris pv. campestris type II secretion apparatus. J. Bacteriology 183(2): 528-535. (SCI)
- Lee HM, Wang KC, Liu YL, Yew HY, Chen LY, Leu WM, Chen DC and Hu NT (2000) Association of the cytoplasmic membrane protein XpsN with the outer membrane protein XpsD in the type II protein secretion apparatus of Xanthomonas campestris pv. campestris. J. Bacteriology 182(6):1549-1557. (SCI)
- Leu WM, Cao XL, Wilson TJ, Snustad DP and Chua NH (1995) Phytochrome A and Phytochrome B mediate the hypocotyl-specific downregulation of TUB1 by light in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 7, 2187-2196. (SCI)
- Shevell DE, Leu WM, Gillmor CS, Xia G, Feldmann KA and Chua NH (1994) EMB30 is essential for normal cell division, cell expansion, and cell adhesion in Arabidopsis and encodes a protein that has similarity to Sec7. Cell 77:1051-1062. (SCI)
- Chen LY, Chen MY, Leu WM, Tsai TY and Lee YHW (1993) Mutational study of Streptomyces tyrosinase trans-activator MelC1. MelC1 is likely a chaperone for apotyrosinase. J. Biol. Chem. 268(25):18710-6. (SCI)
- Leu WM, Chen LY, Liaw LL and Lee YHW (1992) Secretion of the Streptomyces tyrosinase is mediated through its trans-activator protein, MelC1. J. Biol. Chem. 267(28): 20108-13. (SCI)
- Chen LY, Leu WM, Wang KT, and Lee YHW (1992) Copper transfer and activation of the Streptomyces apotyrosinase are mediated through a complex formation between apotyrosinase and its trans-activator MelC1. J. Biol.Chem. 267(28):20100-7. (SCI)
- Tseng HC, Lin CK, Hsu BJ, Leu WM, Lee YHW, Chiou S. J., Hu N.-T. and Chen C. W. (1990) The melanin operon of Streptomyces antibioticus: expression and use as a marker in gram-negative bacteria. Gene 86(1): 128-8. (SCI)
- Leu WM, Wu SY, Lin JJ, Lo SJ and Lee YHW (1989) Analysis of the promoter region of the melanin locus from Streptomyces antibioticus. Gene 84: 267-277. (SCI)
- Lee YHW, Chen BF, Wu SY, Leu WM, Lin JJ, Chen CW, and Lo S. J. (1988) A trans-acting gene is required for the phenotypic expression of a tyrosinase gene in Streptomyces. Gene 65:71-81. (SCI)
研討會論文
- Su SM, Tsai CC, Lee WZ, Tseng YY, Huang JA, Tesng TH, Ku SM, Wang CS, Leu WM (2007) Molecular characterization and genetic analysis reveal SA0420 as an early senescing rice mutant with pleotropic phenotypes. July 7-11, 2007, Chicago, Illinois, USA, Plant Biology & Botany 2007 Joint Congress. (Abstract ID 1312)
- Chen WC, Wang YY, Tung YJ and Leu WM (2005) Functional analysis of a calcium-dependent calmodulin-independent protein kinase in rice pollen.
- Fifth Cross-strait Symposium on Plant Molecular Biology and Biotechnology (Lecture).
- Chen WC, Wang YY, Tung YJ and Leu WM (2005) Functional analysis of a calcium-dependent calmodulin-independent protein kinase in rice pollen. Symposium on Rice Genetics and Genomics (Lecture).
- Su HM, Wang CS, Tsai CC and Leu WM (2003) Molecular Cloning and Characterization of Differentially Expressed Genes in an Aroma Rice Mutant, SA0420. 7th International Congress of Plant Molecular Biology S01-11 (Abstract)
- Yang YY, Chung MC, Yang JY and Leu WM (2003) OSAP1, encodes an aspartic protease-like protein, expresses synchronally with the degeneration of nucellus in rice. Japan/Taiwan Symposium on Molecular Biology of Functional Regulation in Plant and Microbe (Lecture and Proceedings)
- Lee DC, Yang JY and Leu WM (2000) A rice cDNA encoding a putative calcium-dependent protein kinase is predominantly expressed in pollen. 6th International Congress of Plant Molecular Biology S25-17 (Abstract)
- Yang JY and Leu WM (2000) Isolation and characterization of two rice cDNAs encoding putative guanine nucleotide-exchange proteins for ADP-ribosylation factor. 6th International Congress of Plant Molecular Biology. S13-20 (Abstract)
- Leu WM, Yang YY, Yang JY and Chung MC (2000) OSP encodes an aspartic protease-like protein expresses synchronally with the degeneration of nucellus in rice. 6th International Congress of Plant Molecular Biology. S11-17 (Abstract)
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